برای تهیه این محیط کشت مقدار ۷۵/۰ گرم آگار باکتریولوژی( برای کشت باکتری) و ۱ گرم از محیط LB در ۵۰ میلی لیتر آب دیونیزه اضافه و در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید. بعد از اتوکلاو کردن این محیط، زمانی که دمای محیط به ۵۵ درجه سانتی گراد رسید به محیط ۱۷۵ میکرولیتر آمپی سیلین(mg/ml20،۲۰ میلی گرم آمپی سیلین را در یک میلی لیتر از آب مقطر حل کرده)، ۶۰ میکرولیتر IPTG (mg/ml 25، Isopropyl beta D-thiogalactoside درحلال آب مقطر) و ۵۰ میکرولیتر X-gal (mg/ml40، مقدار ۴۰ میلی گرم از X-Gall را در یک میلی لیتر از دی متیل فورمامید حل کرده) اضافه نموده و بعد محیط کشت را به پتری ها اضافه می نمائیم.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۵-۵- انتخاب پرگنه جهت استخراج پلاسمید نوترکیب
حدود ۱۸ ساعت بعد از عمل ترانسفورماسیون، دو نوع پرگنه سفید و آبی بر روی محیط کشت تشکیل می گردد. پرگنه های سفید رنگ احتمالا حاوی پلاسمید نوترکیب می باشند. جهت اطمینان از این امر، ابتدا واکنش PCR انجام گردید. بدین منظور نیمی از پرگنه را با نوک پیپت برداشته و به تیوب محتوی مخلوط PCR اضافه می نمائیم.PCR درون دستگاه ترموسایکلر براساس برنامه استفاده شده در مرحله ابتدائی انجام می گیرد. تعدادی از پرگنه سفید رنگی که باند مورد نظر را نشان داد با بهره گرفتن از خلال دندان استریل داخل لوله محتوی محیط کشت LB مایع (همراه با ۲۰ میکرولیترآمپی سیلین) کشت گردید و سپس لوله ها جهت رشد باکتری، به مدت یک شب در شیکر انکوباتور با ۱۳۰ دور در دقیقه و دمای ˚C37 قرارگرفتند.
۳-۵-۶- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری توسط روش Boiling:
این روش برگرفته از روش Holmes & Quigley (1981) می باشد:
۱- ابتدا ۵/۱ میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری موردنظر به تیوب های ۵/۱ میلی لیتری استریل اضافه گردید و سپس در۱۳۰۰۰دور به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ گردید.
۲- مایع رویی بیرون ریخته شد و با وارونه قرار دادن تیوب بر روی دستمال کاغذی استریل، رسوب باکتری خشک گردید، پس از آن ۳۵۰ میکرولیتر از بافر STET به رسوب اضافه شد (جدول ۳-۱۲).
۳- به منظور حل نمودن رسوب در محلول، ورتکس انجام شد. سپس ۵/۱۲ میکرولیتر لیزوزیم (حل شده در بافرTrizma-base ده میلیمولار و اسیدیته ۸) به محلول اضافه و با دست ۳-۶ بار به آرامی به هم زده شدند.
۴- تیوب ها به مدت ۱ دقیقه در آب جوش قرار داده شدند.
۵- پس از جوشاندن تیوب ها در ۱۳۰۰۰ دور به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ گردیدند.
۶- بعد از اتمام سانتریفیوژ رسوب حاصل با بهره گرفتن از خلال دندان استریل حذف گردید.
۷- در این مرحله ۴۰ میکرولیتر استات سدیم ۳ مولار و ۲۲۰ میکرولیتر ایزوپروپانول (در فریزر) به مخلوط اضافه شد و سپس با دست۳-۶ بار به آرامی به هم زده شد.
۸- تیوب ها در ۱۳۰۰۰ دور به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ گردیدند.
۹- محلول رویی حذف شد. رسوب حاصله به صورت وارونه بر روی دستمال کاغذی استریل خشک شد.
۱۰- رسوب با ۵۰۰ میکرولیتر اتانول ۸۰ درصد شسته و سپس خشک گردید. پس از آن تیوب ها به مدت ۱۰ دقیقه در vaccum قرار داده شدند تا رسوب آنها کاملا خشک گردد.
۱۱- در آخرین مرحله ۳۰ میکرولیتر آب حاوی RNase (20mg/ml) به رسوب اضافه و کاملا حل گردید.
۳-۵-۷- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری توسط High Pure Plasmid Isolation Kit, (Roche,Germany, Cat No:11754785001)
۱- ابتدا محیط کشت های حاوی باکتری، داخل تیوب های ۵/۱ میلی لیتری اضافه و سپس در g9000 دور به مدت زمان ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ انجام شد.
۲- محلول رویی را بیرون ریخته و مجددا از همان محیط کشت حاوی باکتری به رسوب اضافه شد. پس از آن سانتریفیوژ در مدت زمان ۳۰ ثانیه در ۹۰۰۰ دور انجام و رسوب ها به صورت وارونه بر روی دستمال کاغذی خشک شدند.
۳- ۲۵۰ میکرولیتر از Suspention buffer ( داخل یخچال) حاوی RNaseکه در کیت به صورت آماده می باشد، بر روی رسوب اضافه و سپس ورتکس انجام شد تا رسوب کاملا حل شود.
۴- ۲۵۰ میکرولیتر از Lysis buffer به محلول بالااضافه و محلول حاصل با دست ۳-۶ بار به آرامی مخلوط شدند، سپس ۵ دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند.
۵- ۳۵۰ میکرولیتر Binding buffer ( قبل از شروع کار روی یخ می گذاریم) به محلول بالا اضافه و سپس با دست۳-۶ بار به آرامی به هم زده شدند. آنگاه ۵ دقیقه بر روی یخ نگهداری شدند.
۶- محلول بالا در حداکثر دور و به مدت ۱۰ دقیقه (به منظور رسوب پیکره های باکتری) سانتریفیوژ گردید که در این حالت پلاسمید ها در محلول رویی باقی می ماند.
۷- محلول رویی به تیوب های فیلتردار اضافه و سپس به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه در۱۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شدند. مایع جمع شده در زیر تیوب ها دور ریخته و مجددا تیوب فیلتر دار جدید جایگزین آن شد.
۸- ۵۰۰ میکرولیتر از Washing buffer Іبر روی تیوب فیلتردار اضافه و در ۱۴۰۰۰ دور به مدت۳۰-۶۰ ثانیه سانتریفیوژ شدند. پس از آن مایع جمع شده در ته تیوب دور ریخته شدند و در ۱۴۰۰۰ دور و به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه در ۱۴۰۰۰ دور سانتریفیوژ شدند. رسوب جمع شده درته تیوب دور ریخته شدند.
۱۰- یک بار دیگر تیوب های فیلتر دار خالی، به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه در ۱۴۰۰۰ دور سانتریفوژ شدند تا مایع Washing buffer به طور کامل خارج گردند.
۱۱- تیوب زیری دور انداخته شد و فیلترها درون تیوب های ۵/۱ میلی لیتری تمیز گذاشته شدند.
۱۲- ۱۰۰ میکرولیتر از Elution bufferبا دقت روی فیلترها ریخته و به مدت ۳۰ ثانیه در ۱۴۰۰۰ سانتریفیوژ شد.
۱۳-در انتها ۱۰۰ میکرولیتر پلاسمید به دست آمد.
۳-۵-۷-۱- مواد تشکیل دهنده بافرهای استفاده شده در استخراج پلاسمید
۱- مواد تشکیل‌دهندهSuspension buffer
۵۰mM Tris-HCl و ۱۰mM EDTA,pH:8.0(25C)
۲- مواد تشکیل دهنده Lysis Buffer
۰.۲M NaoH و ۱% SDS
۳- مواد تشکیل دهنده Binding buffer
Guanidine-HCl M 4 و ۰.۵M Potassium acetate, pH:4.2
۴- مواد تشکیل‌دهنده بافر شستشو(Wash buffer I)
Guanidine-HCl M 5 و۶.۶ ۲۰mM Tris-HCl‚ pH:
۵- مواد تشکیل‌دهنده بافر شستشو(Wash buffer II)
۲۰mM NaCl و ۲mMTris-HCl,pH:7.5
۶- مواد تشکیل‌دهنده Elution buffer
۱۰mM Tris-HCl,pH:8.5
۳-۵-۸- هضم آنزیمی پلاسمید (Digestion)
برای اطمینان بیشتر از انجام عمل همسانه سازی، نمونه هایی که در مرحله قبل واکنش آزمون PCR آنها مثبت بود، انتخاب و عمل هضم آنزیمی بر روی آنها انجام گرفت (جدا شدن قطعه Insert از پلاسمید بعد از عمل هضم آنزیمی نشان دهنده انجام همسانه سازی می باشد). بدین منظور در ابتدا یک مخلوط اولیه^[۸۰] با اجزا موجود در جدول ۳-۱۲ تهیه شد. ۱۰ میکرولیتر از مواد Supermix همراه با ۱۰ میکرولیتر پلاسمید درون تیوب ۵/۰ میلی لیتری در دمای۳۷ درجه سانتیگراد در حمام آب گرم به مدت ۲ الی ۲۴ ساعت قرار داده شد.
۳-۵-۹- انجام الکتروفورز جهت بررسی صحت انجام عمل هضم آنزیمی پلاسمید و همسانه سازی
برای اطمینان از انجام عمل هضم آنزیمی، نمونه ها در روی ژل آگارز %۱ منتقل گردیدند. از هر نمونه ۳ میکرولیتر با ۲ میکرولیتر محلول رنگی (Loading dye) مخلوط گردید. این مخلوط درون چاهک های ژل اضافه گردید. به منظور اطمینان از همسانه سازی قطعات مختلف ژنوم TAV، ۳ میکرولیتر از محصول PCR به عنوان شاهد مثبت در یکی از چاهک های مجاور اضافه و عمل الکتروفورز انجام شد.
۳-۶- نگهداری باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب
به منظور نگهداری باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب ۷۰۰ میکرولیتر محیط کشت مایع LB و باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب با ۳۰۰ میکرولیتر گلیسرول ۱۰ درصد مخلوط شد. سپس این مخلوط در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگهداری شد.
۳-۷- آماده سازی نمونه ها به منظورتعیین توالی نوکلئوتیدی
نمونه های همسانه سازی شده، پس از عمل الکتروفورز و اطمینان از تشکیل باند مورد نظر، برای تعیین توالی آماده سازی گردیدند. بدین منظور ابتدا باکتریها را کشت مایع LB (حاوی آمپی سیلین) داده و به مدت ۱۸تا ۲۰ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد بر روی شیکرانکوباتور با دور ۱۳۰ قرار داده و در روز بعد باکتری ها به محیط کشت جامد LB (حاوی آمپی سیلین) به صورت پنج ضلعی منتقل گردیدند. روز بعد قطعه ای از محیط کشت همراه با تک کلونی از باکتری به صورت وارونه به تیوپ حاوی محیط کشت LB دارای آمپی سیلین (مورب) وارد نموده و به مدت یک شب دردمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده و سپس جهت تعیین ترادف توکلئوتیدی به کمپانی Macrogene در کشور کره جنوبی ارسال گردیدند.
۳-۸- تعیین ترادف ژنوم کامل جدایه ایرانی ویروس بیبذری گوجه فرنگی مجزا شده از گیاه اطلسی (Ker.Mah.P) و ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی (Ker.Ker.Ch.1) و مقایسه آنها با سایر جدایه های موجود در بانک ژن
نمونه ها پس ازارسال به کمپانی ماکروژن با دستگاهAutomatic Sequencer 3730XL تعیین ترادف شدند. به منظور تعیین موقعیت تاکسونومیکی دو جدایه ایرانی TAV، نتایج حاصل ازتعیین ترادف با فرمت الکتروگرام Chromas با استفاده ازنرم افزارChromas Version 1.41 مورد بررسی قرار گرفتند. پس از حذف ترادف های جانبی مربوط به قسمتی از ناقل، این ترادف ها ویرایش شده و به شکل فایل هایی با فرمت FASTA.text آماده گردیدند. آنگاه این ترادف ها با ترادف های موجود در بانک ژن درشبکه NCBIhttp://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)) و با جستجوی بلاست مقایسه شدند. در ضمن بررسی ترادف ها با استفاده ازنرم افزار (Lynnon Biosoft. 1994-98) DNAMAN Version 4.02 بر اساس روش Neighbor-Joining صورت گرفت و درخت های فیلوژنتیکی نیز با بهره گرفتن از این نرم افزار رسم گردیدند.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱- شناسایی و معرفی ویروس بی بذری گوجه فرنگی در ایران
در مطالعهای که به منظور شناسایی و معرفی ویروس TAV ازایران صورت گرفت، طی دی ۸۸ لغایت مرداد ماه سال ۹۰ تعداد ۴۱۳ نمونه گیاهی از مزارع گوجه فرنگی استان های یزد،کرمان، همدان، آذربایجان غربی و مزارع فلفل استانهای فارس و یزد و مناطق گلکاری منطقه ماهان و شهر های کرمان،شیراز، تبریز، همدان، نمونه برداری به عمل آمد. گیاهان جمع آوری شده شامل گوجه فرنگی، فلفل و گلهای اطلسی، داوودی، مارگریت، همیشه بهار، کوکب، ستاره ای، جعفری، تاج خروس، ابری و اختر بودند. جهت تأئید آلودگی نمونه ها، از آزمون الایزا به روش ساندویچ دوطرفه استفاده گردید. نتایج به دست آمده از این آزمون ها بیانگر شناسایی و وجود ویروس بی بذری گوجه فرنگی در کشور بود و این ویروس برای اولین بار در ایران از روی گیاهان اطلسی و داوودی شناسایی گردید (جدول ۴-۱). لازم به ذکر است که ویروس TAV برای نخستین بار در دنیار از روی گیاه اطلسی به عنوان میزبان طبیعی این ویروس شناسایی و گزارش می گردد.
با توجه به اینکه ویروس بی بذری گوجه فرنگی برای نخستین بار در ایران شناسایی گردیده و در مورد آن تاکنون، هیچ گونه مطالعاتی در کشور صورت نگرفته، لذا جدایه اطلسی ویروس TAV به دست آمده از منطقه ماهان استان کرمان به منظور مطالعات مولکولی و تکثیر طول کامل ژنوم و به دنبال آن تعیین موقعیت تاکسونومیکی جدایه ایرانی این ویروس و همچنین مطالعات بیولوژیکی و تعیین دامنه ی میزبانی ویروس مورد بررسی واقع گردید. همچنین جدایه داوودی این ویروس نیز جهت تکثیر ژن کد کننده پروتئین پوششی (CP) ، تعیین موقعیت تاکسونومیکی و تعیین دامنه ی میزبانی انتخاب گردید.