تانک الکتروفورز مدل افقی و منبع تغذیه.
دستگاه UV Trans luminator مدل UV,BTS-20-M.
۳-۲- مواد و لوازم مصرفی
سمپلرهای ۱۰-۱، ۱۰۰-۱۰ و ۱۰۰۰-۱۰۰ میکرو لیتر SOCOREX.
سر سمپلر زرد و آبی.
لوله های مخروطی میکرو تیوپ ml 2/0 و ۵/۰ .
ارلن ، بشر ، مزور(استوانه مدرج).
کیت استخراج DNA شرکت “سیناژن” حاوی انواع بافر و پروتئاز و حلال پروتئاز.
مستر میکس شرکت بیوتک پیشگام Taq DNA Polymerase 2x Master Mix Red.
بافر TAE (Tris Acetate ETDA) 1x.
پودر آگاروز ۵/۱ %.
شناسگر اندازه DNA (Gen Ruller 100b.p Ladder) شرکت بیوتک پیشگام.
نمونه کنترل منفی حاوی پرایمرهای FORWARD , REVERSE ، آب ۲ بار تقطیر و Master Mix .
آب ۲ بار تقطیر ( H₂O ).
اتانول ۱۰۰ و ۹۶ درصد ( C₂H₅OH ).
سفارش و ساخت پرایمر فوروارد و معکوس توسط شرکت دانا ژن پژوه.
۳-۳- روش ها و تکنیک ها
۳-۳-۱- نمونه برداری
در این پژوهش، از ۲۷ نفر زن در درمانگاه نازایی ولی عصر(عج) بیمارستان امام خمینی(ره) شهر تهران نمونه خون محیطی جمع آوری گردید. از بین افراد مراجعه کننده به درمانگاه ذکر شده تعداد ۱۴ نفر بیمار مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک انتخاب شدند و همچنین تعداد ۱۳ نفر افراد سالم به عنوان گروه شاهد انتخاب گردید.
لازم به ذکر است که در بیماران انتخاب شده مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک، تشخیص اولیه بر مبنای شرح حال، معاینات بالینی، آزمایشات لازم، سونوگرافی و رد سایر بیماری ها نظیر نئوپلاسم، هیپرپلازی مادرزادی آدرنال بود که توسط پزشک متخصص درمانگاه ولی عصر(عج) قبلاً صورت گرفته و درمان دارویی هنوز آغاز نگردیده بود.
گروه شاهد را افرادی تشکیل دادند که در خارج از بیمارستان امام خمینی (ره) بودند و از طریق پرسشگری های انجام پذیرفته شده به درمانگاه مذکور فراخوانده و نمونه خون محیطی از ایشان گرفته شد. این گروه از زنان سابقه سندرم تخمدان پلی کیستیک را در خود و خانواده هایشان نداشتند و تشخیص همانند گروه بیمار بر اساس شرح حال، معاینات بالینی، آزمایشات لازم، سونوگرافی می باشد.
در نهایت از هر نفر ۵ میلی لیتر خون وریدی دریافت و در لوله آزمایش ریخته شد. نمونه های خون برای جلوگیری از منعقد شدن با بافر EDTA مخلوط گردید و تا زمان شروع استخراج در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۳-۲- استخراج DNA ژنومیک
استخراج DNA، اولین و مهم ترین نیاز در اجرای تحلیل های ژنتیکی، مانند تشخیص جهش و پی بردن به توالی و عملکرد بخش ویژه ای از ژنوم است. موفقیت های ناشی از استخراج مناسب DNA به خلوص عالی و غلظت بالای DNA استخراج شده وابسته است. معمولاً کیفیت DNA با عواملی مانند عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیم Taq پلیمراز (Taq DNA Polymerase ) در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و آنزیم های برشی مزاحم، سنجیده می شوند] ۶[.
مولکول هایDNA در مقایسه با توالی های پروتئینی، بسیار بزرگتر و پیچیده تر می باشند. هر یک از مولکول های DNA هسته ای اغلب حاوی صدها میلیون نوکلئوتید هستند. وقتی DNA با بهره گرفتن از روش های استاندارد از سلول ها جدا سازی می شود، مولکول های عظیم آن بر اثر نیروهای برشی قطعه قطعه و مخلوط های پیچیده ای از قطعات DNA بسیار بزرگ (به طول ۵۰ تا ۱۰۰کیلو باز) را ایجاد می کنند، که در این حالت چالش مورد مواجهه نحوه آنالیز آن است. در نتیجه با بهره گرفتن از روش اولترا سانتریفیوژ در گرادیان های چگالی تعادلی، معمولاً DNA به دست آمده از یک سلول به صورت یک نوار اصلی که نمایانگر توده DNA است، تفکیک می شود ]۱٫[
در این پژوهش استخراج DNA ژنومیک از طریق کیت استخراج DNA سیناژن (CinnaGen) ایران ، انجام پذیرفت.
۳-۳-۲-۱- استخراج DNA با بهره گرفتن از کیت شرکت سیناژن
مبنای کار استخراج DNA دو مرحله کلی دارد: ۱- آزاد سازی DNA مورد بررسی از داخل سلول و لیز کردن آن توسط بافر لیز کننده. ۲- حذف مواد آلی و تغلیظ DNA توسط بافرهای موجود در کیت. اما تفاوت های کوچکی در به کارگیری مواد و مقدار آن ها در مقایسه با کیت سینا ژن وجود دارد. با بهره گرفتن از این روش، DNA طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت استخراج گردید. اطلاعات مربوط به کیت مذکور در جدول ۳-۱ به اندازه ی یک نمونه لیست شده است.
جدول ۳-۱- مواد لازم برای استخراج DNA توسط کیت سیناژن برای ۱نمونه