تهیه بافر STE (Sodium Cloride , Tris. EDTA)
مواد مورد نیاز: NaCL 1/0 مولار، Tris اسیدی ۰۵/۰ مولار ، EDTA 01/0 مولار، NaOH 01/0 مولار
نحوه ساخت بافر: جهت ساخت ۵۰۰ میلی‌لیتر STE، ۹۲۲/۲ گرم NaCl 1/0 مولار، ۳ گرم تریس ۰۵/۰ مولار و ۸۶/۱ گرم EDTA 01/0 مولار را در ۴۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر دوبار تقطیر حل نموده و pH را با بهره گرفتن از محلول آب و سود به ۸ رسانده و حجم نهائی به ۵۰۰ میلی‌لیتر افزایش داده می‌شود.
تهیه SDS 20 درصد (سدیم دودسیل سولفات)
مواد مورد استفاده: کریستال SDS، HCL و آب مقطر
نحوه ساخت محلول: مقدار ۱۰۰ گرم کریستال SDS در ۴۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر در دمای ۶۸ درجه سانتیگراد حل گردید. با افزودن HCL، pH را به ۲/۷ رسانده و سپس حجم محلول به ۵۰۰ میلی‌لیتر رسانده شد و در نهایت این محلول در دمای آزمایشگاه نگهداری گردید.
بافر TAE (Tris, Acetic Acid, EDTA)
مواد مورد استفاده: Na₂EDTA ، Tris و اسید استیک گلاسیال
طرز تهیه: مقدار ۴/۴۸ گرم تریس در ۵۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل گردید، سپس ۲۰ میلی‌لیتر Na₂EDTA نیم مولار و ۴۲/۱۱ میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال به بافر اضافه شد. حجم محلول با بهره گرفتن از آب مقطر به یک لیتر رسانده و در دمای اتاق نگهداری گردید.
آمونیوم پر سولفات^[۲۵] (A.P.S)
مواد مورد استفاده: پودر آمونیوم پر سولفات ، آب مقطر.
نحوه ساخت: یک گرم پودر APS را در ۱۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و و در دمای ۴ درجه نگهداری می شود.
TEMED
این ماده به صورت محلول بوده و فوق العاده سمی است. TEMED دارای خاصیت کاتالیزوری جهت تسریع پلیمریزه شدن ژل آکریل است.
بافر سنگین کننده (Loading Buffer)
مواد مورد استفاده: برموفنل ۱%، زایلن سیالن ۱%، گلیسرول ۵۰%
نحوه ساخت: مقدار ۲۵۰ گرم برموفنل بلو با ۲۵۰ گرم زایلن سیالین را در ۳۳ میلی‌لیتر تریس ۱۵۰ میلی‌مولار (۶/۷pH=) حل نموده و پس از آن مقدار ۶۰ میلی لیتر از ماده گلیسرول و مقدار ۷ میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کرده و محلول فوق در دمای آزمایشگاه نگهداری گردید.
تهیه آکریل آمید ۳۰ درصد
مواد مورد استفاده: آکریل آمید ، متیلن بیس اکریل آمید، آب مقطر.
طرز تهیه: ۴۹ گرم آکریل آمید به همراه یک گرم متیلین اکریل آمید (N , N methylen bis acrylomid) در ۷۰ میلی‌لیتر آب مقطر به ۱۰۰ سی‌سی رسانده و در دمای ۴ درجه نگهداری می‌شود.
تهیه TBE X 10 (Tris, Boric Acid, EDTA)
مواد مورد استفاده: تریس بازی، اسید بوریک، EDTA نیم مولار و آب مقطر.
نحوه ساخت: برای تهیه یک لیتر بافر TBE 10X، ۱۰۸ گرم تریس بازی به همراه ۵۵ گرم اسید بوریک و ۴۰ میلی‌لیتر EDTA نیم مولار (pH=8) مخلوط نموده و حجم نهایی به وسیله آب مقطر دو بار تقطیر به یک لیتر رسانده می­ شود.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

فنل کالیبره
فنل کالیبره با توجه به خطرات و مشکلاتی که برای آماده سازی آن وجود داشت، بصورت آماده از شرکت سیناکلون خریداری گردید.

۳-۳- نحوه استخراج DNA

در این مطالعه از روش فنل- کلروفرم (هیلیس و همکاران، ۱۹۹۶) جهت استخراج DNA استفاده شد.
مواد مورد نیاز: فنل متعادل (pH=8)، کلروفرم، ایزوامیل الکل، بافر STE، اتانول مطلق ۷۰ درصد، پروتئیناز K، محلول SDS 20 درصد (سدیم دوسیل سولفات)، آب مقطر تزریقی و بافت مورد نظر.
وسایل مورد نیاز: قیچی، میکروسانتریفیوژ، ترمومیکسر، شیکر، تیوپ، رک، نمونه‌بردارها و نوک‌های نمونه­بردار آن­ها با قابلیت نمونه­برداری ۱۰۰۰، ۱۰۰ و ۲۰ میکرولیتر، دستکش یکبار مصرف.

۴-۳- مراحل استخراج DNA

۱۰۰ تا ۵۰۰ میلی‌گرم بافت باله را در یک ویال ۵/۱ میلی‌لیتری استریل قرار داده شد.
اضافه کردن ۵۰۰ میکرولیتر بافر STE به هر نمونه؛ اضافه کردن ۳۰ میکرولیتر بافر SDS و ۱۰ میکرولیتر پروتئیناز K به هر نمونه؛
فعالیت اپتیمم پروتئیناز K قلیائی و در دمای ۵۰-۶۰ درجه سانتیگراد می‌باشد. بدیم منظور تیوپ‌ها را در ترمومیکسر با دمای ۵۵ درجه سانتیگراد با تعداد دور rpm600 به مدت ۵ تا ۲۴ ساعت قرار گرفتند تا بافت­ها بطور کامل هموژن شوند و به صورت امولسیون غلیظ درآیند.
۴- سپس به­منظور جداسازی پروتئین از بافت و حل نمودن چربی­ها به هر تیوب ۵۰۰ میکرولیتر فنل اشباء (۸=pH) اضافه شد. تیوب­ها چند بار با ورتکس مخلوط شده و بمدت ۳۰-۲۰ دقیقه شیکر شده و سپس با دور ۱۳۰۰۰ و بمدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ گردیدند.
۵- سپس فاز بالایی به آرامی توسط یک نمونه بردار با ظرفیت کم (۲۰ تا ۵۰ میکرو لیتر) با دقت جدا و در داخل تیوب جدیدی انتقال داده شد. برای حذف فنل باقی مانده به هر تیوپ جدید ۵۰۰ میکرو لیتر کلروفرم اضافه شد و سپس بمدت ۲۰ دقیقه شیکر شده و بدنبال آن سانتریفوژ۱۳۰۰۰ دور بمدت ۱۰ دقیقه انجام گردید. سپس مجددا فاز رویی جدا و به داخل تیوپ جدیدی انتقال یافت و به هر تیوپ جدید ۸۰۰ میکرولیتر اتانول مطلق سرد اضافه گردید.
۶- به هر نمونه ۴۰ میکرولیتر استات سدیم سه مولار اضافه شده و سپس به آرامی تیوب‌ها را سرو ته نموده و بدنبال آن سانتریفوژ بادور گردش۱۳۰۰۰ دور بمدت ۱۵ دقیقه انجام گردید. بعد از اتمام سانتریفوژ بر کف تیوب رسوب سفیدرنگ DNA دیده شد.
۷- الکل و استات را دور ریخته و به هر تیوپ ۲۰۰ میکرولیتر الکل ۷۰% اضافه شد، سپس به مدت دو دقیقه عمل سانتریفیوژ با سرعت ۱۳۰۰۰ دور صورت گرفت. پس از آن الکل را خالی و اقدام به خشک نمودن تیوب­ها گردید. جهت تبخیر کامل الکل، تیوب­های حاوی DNA بمدت ۱۵ الی ۲۰ دقیقه در دمای ۵۰ درجه سانتی‌گراد در انکوباتور قرار داده ­شدند بطوری که در انتها تیوب­ها بوی الکل نمی­دادند.
۸- بعد از خشک شدن کامل تیوب و رسوب DNA، مقدار ۱۰۰ میکرو لیتر آب مقطر استریل به هر یک از تیوب­ها اضافه گردید و به مدت ۳۰ دقیق در بن­ماری با دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرار گرفتند تا DNA استخراجی بطور کامل حل شود و قطعات RNA باقی­مانده نیز هضم شوند. پس از این مدت تیوب­های حاویDNA در فریزر با دمای ۲۰- نگهداری گردیدند.

۵-۳- ارزیابی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده

کیفیت DNA استخراجی با بهره گرفتن از ژل آگاروز یک درصد و کمیت آن نیز با بهره گرفتن از روش اسپکتروفتومتری بررسی گردید.
ارزیابی کمیت DNA استخراج شده با بهره گرفتن از روش اسپکتروفتومتری
تجهیزات مورد نیاز: دستگاه بیو­فتومتر
روش ارزیابی: برای تعیین کمیت DNA نمونه‌ها پس از کالیبره کردن دستگاه اسپکتروفتومتر با آب مقطر، ۲۰ میکرولیتر DNA ژنومی به وسیله آب مقطر به حجم ۳۰۰ میکرولیتر رسانده شد، مقدار جذب نوری نمونه­ها در طول موج ۲۶۰ تا ۲۸۰ نانومتر و نسبت جذب در طول موج ۲۶۰ نانومتر به طول موج ۲۸۰ نانومتر به وسیله دستگاه اندازه گیری و ثبت گردید. غلظت DNA با بهره گرفتن از رابطه زیر محاسبه گردید:
= ۵۰ × D × OD260 (ng / ml) غلظت DNA
OD: میزان جذب نوری در طول موج ۲۶۰ نانومتر
D: نسبت رقت
چنانچه نسبت جذب ۲-۸/۱A1/A2 = باشد، مقدارDNA مناسب است و اگر این نسبت بیشتر از ۲ باشد، بیانگر این مطلب است که DNA استخراجی دارای ناخالصی RNA است و اگر نسبت جذب کمتر از ۸/۱ باشد، نشان دهنده ناخالصی به­علت حضور فنل و پروتئین در DNA استخراجی است.