۱) Nicotiona glutinosa: علائم به صورت ایجاد لکه های کلروتیک و نکروتیک، روشن شدن رگبرگ ها، تاولی شدن به همراه بدشکلی برگ ها و کوتوگلی می باشد. در بسیاری از آلودگی ها علائم تشخیصی ایجاد شده توسط این ویروس بر روی این گیاه آزمون به صورت ایجاد برگ های پیچک مانند[۵۰] و علائم چینه دانی[۵۱] در سطح زیرین برگ ها می باشد.
۲ و ۳) Nicotiana clevelendiiو Nicotiona. tabacum: این گونه ها ی توتون حساس تر از N. glutinosa بوده، اما علائم تشخیصی کمتری از قبیل ابلقی، کوتولگی و بدشکلی در برگ ها را تولید می نماید.
۴) Cucumber sativus: اکثر نژادها ی TAV بر روی این گیاه سبب ایجاد لکه های کلروتیک و نکروتیک گردیده، اما در مقایسه با CMV در این گیاه ایجاد آلودگی سیستمیک نمی کند.
۵) Lycopersicum esculentum: علائم این ویروس بر روی گیاه گوجه فرنگی به صورت ابلقی شدید، کوتولگی، بدشکلی برگ ها، افژولش[۵۲] شاخه های انتهایی و تولید میوه ها ی کوچک، بد شکل و بدون بذر می باشد.
۶) Chenopodium amaranticlolar و Chenopodium quinoa: ویروس بر روی برگ ها ی این گیاهان تعداد ی زخم های موضعی کلروز یا نکروز ایجاد می نماید ( Hollings & Stone, 1971).
۷) Vigna sinesis (Cowpea): علائم TAV در لوبیا چشم بلبلی به صورت ایجاد لکه های نکروتیک می باشد. این در حالی است که نژاد تیپ ویروس (TAV-B) قادر به ایجاد آلودگی در این گیاه نمی باشد (Noordam, 1952).
۲-۴-۳-گیاهان تکثیری ویروس بیبذری گوجه فرنگی
رایج ترین گونه های میزبانی جهت تکثیر و نگهداری این ویروس گیاهان توتون گونه های N. clevelendii و N. glutinosaمی باشند. گونه هایN. glutinosa مناسب جهت نگهداری وگونه Nicotiana clevelendii جهت تکثیر و خالص سازی ویروس مناسب می باشند (Hollings & Stone, 1971).
۲-۵- تفاوتهای ویروس بیبذری گوجه فرنگی و ویروس موزائیک خیار
ویروس های TAV و CMV مشابهت بسیاری داشته اما یکسری از تفاوت های تشخیصی در این دو ویروس عبارتند از:
۱-ویروس TAV قادر به ایجاد آلودگی سیستمیک در خیار نبوده و تنها ایجاد لکه نکروتیک می کند. در حالیکه ویروس CMV قادر به ایجاد آلودگی سیستمیک در این گیاه می باشد.
۲- ویروس TAV باعث بی بذری (یا بی بذری تقریبی) در گیاه گوجه فرنگی می گردد. در حالیکه ویروس CMV قادر به ایجاد بی بذری در این گیاه نمی باشد.
۳-ویروس TAV باعث ایجاد علائم چینه دانی در سطح زیرین برگ های چندین گونه از گیاهان توتون می گردد در حالیکه CMV قادر به ایجاد چنین علائمی نمی باشد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۶ – روش های انتقال ویروس بیبذری گوجه فرنگی
ویروس TAV توسط ناقل حشره ای (شته ها)، تلقیح مکانیکی، پیوند و قلمه قابل انتقال است. همچنین این ویروس از طریق بذر نیز منتقل می گردد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۶-۱- انتقال با حشره ناقل
ویروس TAV، توسط شته سبز هلو، شته سیاه داوودی[۵۳] و تعداد زیادی از گونه های دیگر خانوادۀ Aphididae (۲۲ گونه) به صورت ناپایا منتقل می گردد (Edwardson & Christie, 1991).
۲-۶-۲- انتقال با بذر
یک جدایه از ویروس TAV مجزا شده از گیاه گل استکانی[۵۴] بذرزاد بوده است. اما ویروس در گیاهانی از قبیل N. glutinosa، مینای چینی[۵۵]، گوجه فرنگی وN. tabacum ، Chrysanthemum morifolium بذرزاد نمی باشد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۶-۳- انتقال با سس
ویروس TAV به وسیله گیاهان Cuscuta subinclusa و C. europea به سختی منتقل
می گردد، در حالیکه توسط گونه های دیگر سس منتقل نمی گردد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۷- سرولوژی
ویروس TAV با ویروس های CMVو PSV دارای ارتباط سرولوژیک می باشد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۸- ویژگی های فیزیکی و فیزیوشیمیایی
ویریون ها دارای کپسید ایزومتریک بوده، فاقد غشا، گرد تا کشیده، متشکل از ۱۸۰ پلی پپتید با توالی یکسان که به صورت یک بیست و جهی به قطر A˚۲۸ با ۶۰ کپی از هر سه زیر واحد سازمان یافته اند (Habili & Francki, 1974a). پایداری در محیط آزمایشگاهی[۵۶] ۲ تا ۶ روز در ۲۰ درجه سانتی گراد یا ۱۲-۹ ماه دردمای منفی ۵ درجه سانتی گراد است. قدرت آلوده کنندگی در برگ های خرد شده در منفی ۵ درجه سانتی گراد حداقل ۳ سال و در شرایط خلاء در منفی ۱۸ درجه سانتی گراد به صورت خشک و منجمد حداقل ۱۱ سال حفظ می گردد (Hollings & Stone, 1971). درجه حرارت بی اثر شدن[۵۷] در عصاره توتون بعد از ۱۰ دقیقه در طیف دمایی ۵۰، ۵۵ یا ۶۰ درجه سانتیگراد می باشد. بسته به نژاد ویروس و غلظت اولیه، حد نهایی رقت[۵۸] در عصاره توتون حدود ۴-۱۰ تا ۵-۱۰، در عصاره ی clevelandii N. ۵-۱۰ تا ۶-۱۰ و در عصاره داوودی ۲-۱۰ تا ۳-۱۰ می باشد (Hollings & Stone, 1971).
۲-۹- مکانیزم ایجاد بی بذری توسط ویروس بیبذری گوجه فرنگی
ویروس بی بذری گوجه فرنگی در بین پایه ی های داوودی بسیار رایج بوده و از روی این گیاه قابل انتقال به گیاه گوجه فرنگی می باشد. اثر آلودگی ویروس بر روی گیاه گوجه فرنگی به صورت کاهش رشد،کوتولگی، افزایش رشد جوانه های جانبی، بدشکلی برگ ها و ساقه ها می باشد. همچنین این ویروس سبب نکروز و ریزش جوانه های گل گردیده و جوانه های باقی مانده نیز گل هایی با گلبرگ و گاسبرگ غیرعادی تولید می نمایند. میوه های تولید شده در این گیاه نیز فاقد بذر بوده و یا در اکثر موارد بذر کمی تولید می کنند (Caldwell, 1952). دانه های گرده بدشکل و معمولا هیچ دانه ی گرده ی طبیعی تولید نمی کنند. چنین به نظر می رسد که بدشکلی دانه های گرده با عدم توانایی هسته ی سلول مادری میکروسپور جهت انجام پروسه ی طبیعی تقسیمات میوز ودرنتیجه عدم تولید یک تتراد چهار میکروسپوری در ارتباط می باشد (Wilkinson, 1953). همچنین وجود این ویروس در سلول های مادری میکروسپور منجر به تاثیر آلودگی ویروس در مراحل طبیعی میوز می گردد. علاوه بر این هیچ یک از این سلول ها دانه ی گرده ی طبیعی تولید نمی نمایند. همچنین بررسی های بیشتر بیانگر آن است که در مرحله ی پاکیتن (سومین مرحله ی پروفاز) کروموزوم ها بصورت یک توده ی نامنظم متراکم می شوند. ظاهرا در اثر این آلودگی ها حفرات وسیعی درون سلول های مادری میکروسپور ایجاد گردیده و به دنبال آن تجزیه ی سلولی رخ داده و یک توده سلولی مرده درون کیسه ی گرده تشکیل می گردد. همچنین در مورد تخمک ها نیز فرآیندهای میوزی در نتیجه ی آلودگی ویروسی مختل شده و هیچ کاهش کروموزومی اتفاق نمی افتد. هسته ی سلول مادری مگاسپور قادر به انجام میوز طبیعی نبوده و در نتیجه هیچ مگاسپور و یا کیسه ی جنینی تشکل نمی گردد (Caldwell, 1952).
۲-۱۰- زیان های اقتصادی توسط ویروس بیبذری گوجه فرنگی
ویروس TAV مهمترین عامل محدود کننده و خسارت زای گل داوودی در دنیا می باشد(Choi et al., ۲۰۰۱). این گیاه در کشور استرالیا به عنوان یکی از مهمترین کشت های مزرعه ای مطرح می باشد و در سال ۱۹۹۳، ۳۵ میلیون دلار برای این کشور درآمد زایی داشته است. این ویروس هر ساله خسارات زیادی را به این صنعت وارد می نماید. در سال های ۱۹۸۲ در ایالت ویکتوریای استرالیا، میزان آلودگی مزارع داووی تا ۳۰% و در سال ۱۹۹۵، ۷/۶% گزارش گردیده است(Hill et al., ۱۹۹۶) . براساس تحقیقی که در سال ۱۹۷۷ توسط Horst و همکاران بر روی اثر ویروس TAV بر روی گیاه داووی انجام گرفت، مشخص گردید که ویروسTAV (بسته به زمان تلقیح و نوع رقم گل)، به طور متوسط باعث کاهش ۱۸ % در وزن گل های تازه، ۱۸% در طول ساقه هاو ۵ % کاهش در اندازه ی قطر گل ها گردیده است. همچنین آلودگی گیاهان گوجه فرنگی نسبت به نژاد TAV-M (با قدر ت بیماری زایی خفیف) باعث کاهش طول ساقه ها و عملکرد میوه ها به ترتیب به مبزان ۲/۳۱% و ۵/۱۱% گردیده است. بعلاوه اینکه آلودگی گیاهان گوجه فرنگی نسبت به نژاد TAV-B (نژاد تیپ ویروس) سبب کاهش طول ساقه ها به میزان ۷/۷۰% گردیده است (Kuti & Moline, 1986).
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۲-۱۱- نقش پروتئین حرکتی ویروس بیبذری گوجه فرنگی در بروز علائم
دو استرین ویروس بی بذری گوجه فرنگی شامل ۱-TAV و V-TAV از نظر شدت و سرعت علائم القاکننده در گیاه Nicotiana tabacum با یکدیگر متفاوت می باشند. ۱-TAV یک فنوتیپ با علائم شدید را در گیاه ایجاد می نماید، درحالیکه V-TAV باعث بروز یک فنوتیپ با علائم ملایم در گیاه توتون می گردد. طبق بررسیهای مولکولی و ساخت رونوشت عفونتزای قطعات ار.ان.ای این استرینها، مشخص گردید که ژن پروتئین حرکتی نژاد V-TAV مسئول بروز فنوتیپ با علائم ملایم می باشد(Moreno et al., ۱۹۹۷). این پروتئین توسط RNA-3 کد گردیده و در گسترش سلول به سلول در گیاه نقش دارد. بروز این فنوتیپ در نتیجهی جایگزینی یک نوکلئوتید و در نتیجه تولید یک کدون توقف (UAA) در چهارمین جایگاه آمینواسیدی ۳aORF استرین V-TAV می باشد. در واقع وجود این کدون توقف منجر به کاهش بیان پروتئین حرکتی توسط نژاد V-TAV در پروتوپلاست و برگهای توتون آلوده می گردد. در نتیجه سطح پائین پروتئین حرکتی در برگهای آلودهی V-TAV، سرعت حرکت سلول به سلول را محدود کرده و منجر به بروز فنوتیپ با علائم ملایم میگردد. در واقع مقادیر اندک این پروتئین در استرین V-TAV درنتیجهی بیان جمعیت کم و فاقد کدون توقف در چهارمین جایگاه آمینواسیدی ۳aORF می باشد. کاهش سنتز و تجمع پروتئین حرکتی باعث کاهش گسترش سلول به سلول ویروس و در نتیجه تاخیر در دسترسی به آوند آبکش رگبرگها و سیستم آوندی میگردد (Moreno et al., ۱۹۹۷). مدت زمان ورود ویروس به آوند آبکش تعیین کنندهی موفقیت آلودگی سیستمیک در برگهای جوان می باشد (Leisner et al., ۱۹۹۲). بر همین اساس سطح بیان پروتئین حرکتی ویروس، تعیین کنندهی اختلافات موجود در میزان علائم استرین های TAV می باشد (Moreno et al., ۱۹۹۷).
۲-۱۲- نقش پروتئین پوششی ویروس بیبذری گوجه فرنگی در ایجاد آلودگی سیستمیک در گیاه
ویروسهای گیاهی از طریق زخمهای ایجاد شده با تلقیح مکانیکی و یا حشرات ناقل، وارد سلولهای میزبان میشوند. توسعهی آلودگی ویروسی بوسیلهی دو فرایند رخ میدهد: ۱) توسعه ویروسها به صورت سلول به سلول در اپیدرم و مزوفیل، تحت عنوان حرکت سلول به سلول یا مسیر کوتاه. ۲) حرکت در مسیر طولانی که به ویروسها اجازهی ورود به سیستم آوندی و درنتیجه آلودگی سیستمیک را میدهد (Hull, 1991). در حرکت سلول به سلول پروتئینهای حرکتی ویروس (MPs) و فاکتورهای میزبانی نقش دارند (Wolf et al., ۱۹۸۹). این در حالی است که اطلاعات کمی درمورد مکانیزم یا مکانیزم های دخیل در مسیر طولانی از طریق آوند آبکش موجود می باشد. حرکت طولانی مدت آلودگی ویروسی در گیاه میزبان یک فرایند پیچیده بوده و از مراحل مختلفی تشکیل شده است: ۱) ورود ویروس از سلولهای مزوفیل برگهای تلقیح شده به سیستم آوندی. ۲) انتقال از طریق سیستم آوندی. ۳) خارج شدن از سیستم آوندی و ورود به سلولهای مزوفیل برگهای بالایی (Citovsky & Zambryski, 1991). در کوکومویروسها پروتئین حرکتی به تنهایی جهت حرکت در مسیر طولانی کافی نبوده، بلکه پروتئین پوششی نیز جهت آلودگیهای سیتسمیک مورد نیاز می باشد (Boccard & Baulcombe, 1993). شواهد کافی مبنی بر نقش CP ی کوکوموویروسها در حرکت ویروس در مسیر طولانی گیاهان آلوده و عملکرد اختصاصی این پروتئین وجود دارد. گیاه خیار[۵۹] یک میزبان سیستمیک جهت ویروس موزائیک خیار می باشد. درحالیکه استرین ۱ ویروس بی بذری گوجه فرنگی (۱-TAV) در این میزبان قادر به ایجاد آلودگی سیستمیک نمی باشد. ضمنا آلودگی همزمان خیار با CMV و ۱-TAV باعث ایجاد آلودگی سیستمیک در این گیاه می گردد. در این حالت به نظر می رسد که ویروس CMV نقص حرکتی ویروس ۱-TAV را در مسیرهای طولانی و ایجاد آلودگی سیستمیک برطرف می نماید. مطالعات مولکولی بیانگر آن است که تنها پروتئین پوششی CMV جهت آلودگی سیستمیک خیارتوسط ۱-TAV مورد نیاز می باشد. بر این اساس پروتئین پوششی در کوکوموویروس ها نقشی تعیین کننده جهت توسعه ی آلودگی در مسافت های طولانی آوند آبکش دارد و وجود آن جهت آلودگی سیستمیک ضروری می باشد (Taliansky & Garcia-Arenal, 1995).
۲-۱۳- هیستولوژی
همه بافت های گیاهی می توانند توسط TAV آلوده شوند و این ویروس در همه نقاط گیاه خصوصاً سلول های مزوفیل، سیتوپلاسم و واکوئل های سلولی یافت می گردد. علی رغم مشاهده توده ی پیکره های ویروسی در بخش های بسیار نازک پارانشیم برگی، اما هیچ اینکلوژن بادی در آن ها گزارش نگردیده است. همچنین پیکره های ویروسی در پلاسمودسماتای سلول ها و در بین سیسترنای دستگاه گلژی در دو لپه ای ها مشاهده گردیده است (Hatta & Francki, 1981). ویروس در برخی از گیاهان خانواده Solanaceae و در N. glutinosa در تقسیم معمول میتوزی دخالت می نماید (Wilkinson, 1953).
فصل سوم
مواد و روش ها
۳-۱- نمونه برداری
به منظور بررسی و شناسایی ویروس بی بذری گوجه فرنگی در ایران و مطالعات بیو لوژیکی و مولکولی، طی دی ماه ۸۸ لغایت مرداد ماه۹۰ از مزارع گوجه فرنگی استان های یزد، کرمان، همدان، آذربایجان غربی و مزارع فلفل استان های فارس، یزد و مناطق گلکاری ماهان و شهرهای کرمان، شیراز، تبریز، همدان، نمونه برداری به عمل آمد. هر گیاه مشکوک به آلودگی بر مبنای علائمی از قبیل موزائیک، کوتولگی بوته، زردی، تاولی و بدشکلی برگ ها و گل ها به عنوان یک نمونه داخل یک کیسه فریزر قرار داده شد و تاریخ، محل نمونه برداری و نام گیاه بر روی آن درج گردید. نمونه ها بر روی یخ به آزمایشگاه منتقل و تا زمان انجام آزمایش در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در آزمایشگاه بعد از انجام آزمون الیزا نمونه های مثبت جهت مطالعات بیشتر با بهره گرفتن از دستگاه فریز درایر خشک و بعد در درون لوله های مخصوص همراه با کلرید کلسیم نگهداری شدند (جدول ۳-۱ و ۳-۲).
۳-۲- آزمون الایزا
به منظور بررسی وجود آلودگی ویروسی در نمونه ها، آزمون های الایزا براساس روش کلارک و آدامز (۱۹۷۷) و به روش ساندویچ دوطرفه[۶۰] با بهره گرفتن از آنتی بادی چند همسانه ایTAV تهیه شده از کمپانی DSMZ آلمان صورت گرفت.
۳-۲-۱- مراحل الایزای ساندویچ دو طرفه
مراحل این روش به شرح زیر می باشد:
۱- افزودن IgG: با بهره گرفتن از بافر پوششی آنتی بادی ها به نسبت ۱:۱۰۰۰ رقیق و ۱۰۰ میکرولیتر از محلولIgG در هرچاهک میکرو پلیت اضافه و سپس پلیت ها به مدت دو ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور نگهداری گردیدند.
۲- شستشو: محتویات پلیت ها پس از گذشت دو ساعت بیرون ریخته شده و آنگاه به چاهک ها بافر فسفات شستشو (PBS-T) اضافه و به شدت خالی گردیدند. به چاهک های مذکور مجددا بافر شستشو اضافه و این بار به مدت ۵ دقیقه به صورت ساکن باقی ماندند. پس از گذشت ۵ دقیقه محتویات پلیت ها بیرون ریخته شد و برای بار سوم نیز چاهک ها مانند بار اول مجددا شستشو گردیدند. در نهایت چاهک ها ی پلیت ها کاملا خالی و خشک گردیدند.
۳- عصاره گیری: ابتدا با بهره گرفتن از بافر عصاره گیری از نمونه های مشکوک به میزان ۱/۰ گرم برگ در ۱ میلی لیتر بافر(w/v)، عصاره گیری انجام گردید. در مورد شاهد مثبت و منفی از بافت گیاهان آلوده و سالم نیز عصاره گیری به عمل آمد. عصاره به دست آمده در تیوب های ۵/۱ میلی لیتری اضافه و جهت ته نشین شدن بافت های گیاهی به مدت ۲ دقیقه در ۱۰۰۰ دور سانتریفیوژ و از مایع رویی به میزان ۱۰۰ میکرو لیتر به چاهک های پلیت الیزا اضافه و به مدت یک شب در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
۴- شستشو: این مرحله مطابق بند (۲) انجام شد.
۵- اضافه نمودن IgG متصل به آنزیم: در این مرحله آنتی بادی پلی کلونال الحاق شده[۶۱] با آنزیم آلکالین فسفاتاز به نسبت ۱:۵۰۰ در بافر Conjugateرقیق و پس از مخلوط شدن به میزان ۱۰۰ میکرو لیتر به هر چاهک اضافه گردید. سپس پلیت ها به مدت دو ساعت در انکوباتور در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نگهداری گردیدند.
۶- شستشو: این مرحله مطابق بند (۲) انجام گردید.
۷- افزودن سوبسترا: ابتدا ۱۰۰ میکرو لیتر از محلول تازه تهیه شده سوبسترا، شامل نیم میلی گرم پی- نیترو فنیل فسفات (PNPP) در یک میلی لیتر بافر سوبسترا، به هر یک از حفرات پلیت ها اضافه گردید. آنگاه پلیت ها به مدت نیم تا یک ساعت در تاریکی و در دمای اتاق قرار داده شد تا تغییر رنگ مشخص شود.
۸- ارزیابی نتایج: نتایج بر اساس تغییر رنگ سوبسترا با بهره گرفتن از دستگاه الایزا خوان مدل EL800 (Biotek Instrument) ساخت کشور انگلیس، مورد ارزیابی قرار گرفتند. میزان جذب نور در طول موج ۴۰۵ نانومتر برای هر حفره قرائت گردید و نمونه هایی که میزان جذب آنها بیش از سه برابر میانگین نمونه های منفی بود، به عنوان نمونه مثبت محسوب گردیدند ( Clark& Adams, 1977).
۳-۲-۲- بافرهای مورد استفاده در آزمون های الایزا
قبل از انجام آزمون الیزا بافرهای زیر به میزان مورد نیاز تهیه و در یخچال نگهداری گردیدند.
۱- بافر پوششی[۶۲]
۵۹/۱گرم Na2CO3
۹۳/۲ گرم NaHCO3